8 trang |
Chia sẻ: superlens
| Lượt xem: 5810
| Lượt tải : 8
Bạn đang xem nội dung tài liệu Đề tài Phương pháp lai Northern blot, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Môn học : Kỹ thuật di truyền Chủ đề : Phương pháp lai Northern blot Giáo viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Dung Nhóm : 14 Sinh viên thực thi : Nguyễn Thị Trúc Giang 61303495 Nguyễn Thị Ngọc Dung 61303469 Lê Thị Ngọc Bích 61303442 I / trình làng 1 / khái niệm Phương pháp lai Northern blot là phương pháp vận dụng cho RNA, lai DNA-RNA hoặc RNA-RNA. Phương pháp này được sử dụng để xác lập kích cỡ và hàm lượng của một mRNA đặc trưng trong một hỗn hợp RNA. Kỹ thuật lai Northern blot được tăng trưởng vào năm 1977 bởi James Alwine, David Kemp, và George Stark tại Đại học Stanford. 2 / Thủ tục : Bắt đầu với khai thác của tổng số RNA từ một mẫu mô giống hệt hoặc từ những tế bào. Nhân nổi bật mRNA sau đó hoàn toàn có thể được cô lập trải qua việc sử dụng những phương pháp sắc ký oligo ( dT ) cellulose để cô lập chỉ những RNA với poly ( A ) đuôi. Mẫu RNA sau đó được phân làn bằng gel điện. Các mẫu RNA, giờ đây tách ra theo kích cỡ, được chuyển giao cho một màng nylon trải qua một mạng lưới hệ thống mao mạch hoặc máy hút thấm. Mao dẫn thấm thiết lập mạng lưới hệ thống cho việc chuyển giao RNA từ gel điện đến một màng thấm. Các bộ đệm chuyển giao sử dụng cho thấm thường chứa Formamide chính do nó làm giảm nhiệt độ ủ của sự tương tác thăm dò-RNA, do đó vô hiệu sự thiết yếu cho nhiệt độ cao, hoàn toàn có thể gây suy thoái và khủng hoảng RNA. Sau khi RNA đã được chuyển giao cho màng, nó được cố định và thắt chặt trải qua những link cộng hóa trị với màng bằng ánh sáng tia cực tím hoặc nhiệt. Sau đó, nó được lai với RNA trên màng. Điều kiện thí nghiệm hoàn toàn có thể ảnh hưởng tác động đến hiệu suất cao và độ đặc hiệu của lai gồm có sức mạnh ion, độ nhớt, độ dài song công, cặp base sai, và thành phần cơ bản. 3 / Gel : RNA được chạy trên gel agarose formaldehyde, Các mẫu RNA được thông dụng nhất là tách trên gel agarose có chứa formaldehyde như một chất làm biến tính cho RNA để hạn chế cấu trúc thứ cấp. gel được nhuộm với Ethidium Bromide ( EtBr ) và quan sát dưới ánh sáng tia cực tím để quan sát chất lượng và số lượng RNA trước khi thấm. gel Polyacrylamide electrophoeresis bằng urê cũng hoàn toàn có thể được sử dụng trong RNA tách biệt nhưng nó thường được sử dụng cho RNA bị phân mảnh hay microRNA. một thang RNA thường chạy song song với những mẫu trên gel điện để quan sát size của những mảnh vỡ thu được nhưng trong tổng số mẫu RNA những tiểu đơn vị chức năng ribosome hoàn toàn có thể hoạt động giải trí như lưu lại size. 4 / Đầu dò Đầu dò gồm có những axit nucleic với một chuỗi bổ trợ cho toàn bộ hoặc một phần của RNA chăm sóc, nó hoàn toàn có thể là DNA, RNA, hoặc Oligonucleotide với tối thiểu là 25 cơ sở bổ trợ cho chuỗi. những đầu dò cần phải được dán nhãn hoặc gắn với đồng vị phóng xạ ( 32P ) hoặc với Chemiluminescence trong đó Phosphatase kiềm hoặc Peroxidase phá vỡ nền sản xuất Chemiluminescent phát xạ hoàn toàn có thể phát hiện ánh sáng. Việc ghi nhãn chemiluminescent hoàn toàn có thể xảy ra theo hai cách : + Hoặc là thăm dò được gắn vào enzyme + Hoặc thăm dò được dán nhãn với một phối tử ( ví dụ như biotin ) mà những kháng thể ( ví dụ như avidin hay streptavidin ) được gắn vào enzyme phim X-quang hoàn toàn có thể phát hiện cả hai tín hiệu phóng xạ và chemiluminescent ( nhiều nhà nghiên cứu thích những tín hiệu chemiluminescent vì nó nhanh hơn, nhạy cảm hơn, và giảm rủi ro tiềm ẩn sức khỏe thể chất mà đi cùng với nhãn phóng xạ. ) II / Nguyên tắc lai : Dựa trên nguyên tắc bổ trợ giữa cặp bazo nito A-T và G-C. Các đoạn polynucleotit đơn có nguồn gốc khác nhau nhưng có cấu trúc bổ trợ với nhau thì chúng hoàn toàn có thể bắt cặp với nhau tạo ra phân tử lai. Phương pháp này cũng gồm có những bước sau : RNA ( đã được làm biến tính ) sẽ được phân tách theo kích cỡ nhờ điện di trên gel agarose có chứa những chất làm biến tính. Các chất làm biến tính có tính năng khiến những link yếu lao lý cấu trúc bậc 2 của RNA không hề hình thành trở lại sau khi RNA đã biến tính. Và do đó không cản trở sự chuyển dời cũng như sự phân tách những RNA trong gel. Sau đó RNA được chuyển lên mành lai. RNA cố định và thắt chặt trên màng lai được đem lai với mẫu dò có lưu lại phóng xạ. Các phân tử lai được phát hiện nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi. III / Các phương pháp thực thi : Bước 1 : tách chiết và biến tính Tách chiết RNA ra khỏi tế bào Tiến hành điện di hỗn hợp RNA vừa tách trên gel agarose Làm biến tính những dải băng RNA trên gel nhờ dd formaldehyde Bước 2 : thẩm tích Chuyển mRNA lên màng lai nitrocellulo hoặc nilon filte. Dựa trên nguyên tắc mao dẫn : Đệm từ phía dưới được thấm một cách tự nhiên lên trên chuyển những mạch DNA từ gel lên màng và bám chặt vào màng. Kỹ thuật chuyển RNA từ gel agarose lên màng lai Bước 3 : lai với mẫu dò ( probe ) có lưu lại phóng xạ Ủ màng lai với mẫu dò ( probe ) có gắn đồng vị phóng xạ, hoặc chất phát huỳnh quang. DNA cố định và thắt chặt trên màng lai phối hợp Probe theo nguyên tắc bổ trợ. Bước 4 : phóng xạ tự chụp Rửa trôi những probe không được gắn Làm khô Cho chụp phóng xạ tự động hóa Phát hiện số lượng và vị trí nhờ phim phóng xạ tự ghi hoặc hiển thị huỳnh quang IV / Tổng quát : RNA làm biến tính bằng formanldehyde được phân tách theo size nhờ điện di trên gel agarose RNA được chuyển lên màng lai và thẩm tích RNA cố định và thắt chặt trên màng lai được đem lai với mẫu dò được ghi lại phóng xạ Các phân tử lai được phát hiện nhờ kĩ thuật phóng xạ tự chụp V / Ưu, điểm yếu kém của phương pháp lai : 1 / Ưu điểm : Phát hiện kích cỡ RNA, quan sát những mẫu sản phẩm nối thay thế sửa chữa. Việc sử dụng những thiết bị thăm dò với một phần tương đương, chất lượng và số lượng RNA hoàn toàn có thể được đo trên gel trước khi thấm và màng hoàn toàn có thể được tàng trữ trong nhiều năm sau khi thấm. Những gen chip đang khá thông dụng và là thường tương thích với tài liệu thu được từ phương pháp Northern Blot. 2 / Nhược điểm : Một yếu tố ở miền bắc thấm thường là sự xuống cấp trầm trọng mẫu bằng RNases ( cả nội sinh để mẫu và trải qua ô nhiễm thiên nhiên và môi trường ), hoàn toàn có thể tránh được bằng cách khử trùng thích hợp của thủy tinh và việc sử dụng những chất ức chế RNase như DEPC ( diethylpyrocarbonate ). Các hóa chất được sử dụng trong hầu hết những blots Bắc hoàn toàn có thể là một rủi ro tiềm ẩn so với những nhà nghiên cứu, kể từ formaldehyde, chất phóng xạ, ethidium bromide, DEPC và ánh sáng tia cực tím đều gây hại dưới tiếp xúc nhất định. VI / Ứng dụng : TÀI LIỆU THAM KHẢO : Trịnh Đình Đạt. Công nghệ sinh học. Tập 4. NXB Giáo dục đào tạo. Hồ Thị Thùy Dương. Sinh học phân tử. NXB Giáo dục đào tạo. Lê Trần Bình. Cơ sở công nghệ sinh học. Tập 1. NXB Giáo dục đào tạo Nước Ta. Lê Đình Lương. Nguyễn Đình Thi. Kỹ thuật di truyền và ứng dụng. NXB Giáo dục đào tạo .
Source: https://bem2.vn
Category: Ứng dụng hay
